MALDI-TOF, Perspectivas

Comentários sobre artigo publicado no periódico Clinical Chemistry 59:2 (2013),MALDI-TOF Mass Spectrometry: Transformative Proteomics for Clinical Microbiology, Robin Patel

Os Laboratórios de microbiologia modernos atuam utilizando recursos de alta e de baixa tecnologia. Apesar dos grandes avanços no diagnóstico baseado em métodos moleculares por amplificação de material genético, os laboratórios de microbiologia clínica ainda mantêm uma forte dependência de métodos tradicionais, como a cultura, para o diagnóstico de infecções causadas por bactérias e fungos. Isto se deve, em grande parte, à multiplicidade e diversidade de organismos potencialmente patogênicos em uma única amostra.

Após o isolamento dos microrganismos nos meios de cultura, quer sejam meios sólidos ou meios líquidos, existe ainda o processo de identificação e o teste de sensibilidade, também conhecido como antibiograma. A identificação é feita através da análise morfológica e tintorial (ex: cocos ou bastonetes, Gram-positivos ou Gram-negativos) e também utilizando-se de provas bioquímicas, relacionadas à forma com que diferentes germes metabolizam diversos substratos. Na grande maioria dos laboratórios modernos, este processo de identificação é feito através de equipamentos automatizados (por exemplo: VITEK – BioMerieux, Microscan – Siemens e Phoenix – BD). Estes mesmos equipamentos, também são utilizados para a realização dos testes de sensibilidade. Apesar de fornecerem resultados bastante fidedignos na maioria dos casos, estes métodos ainda são demorados e relativamente custosos. Poderíamos estimar o tempo total para o resultado final de uma cultura de 48 a 72 horas, dependendo fortemente do tipo de amostra e do tipo do germe isolado.

A Introdução da Espectrometria de Massa MALDI-TOF tem modificado consideravelmente a rotina dos laboratórios de microbiologia clínica, permitindo que colônias de bactérias (incluindo micobactérias) e fungos sejam identificados de uma forma muito mais simples e rápida, ainda com maior precisão do que os métodos bioquímicos automatizados e com menor custo.

O método baseia-se na combinação da aplicação da espectrometria de massa, que analisa o componente proteico dos microrganismos, com dados de bioinformática. Resumidamente, o processo inicial de cultivo, como a inoculação em meios de cultura, permanece inalterado; entretanto, após o surgimento das colônias, que pode acontecer entre 12 e 48 horas, o processo de identificação feito através do MALDI-TOF leva em torno de 1 hora. Na verdade, a identificação propriamente dita (análise pelo equipamento) não leva mais de dois a três minutos, mas existe um processo de preparação da amostra, antes da colocação para a análise pelo equipamento.

O resultado da identificação pelo MALDI-TOF é mais preciso do que o obtido através dos métodos bioquímicos automatizados, porque não depende da metabolização de substâncias. Além disso, a identificação não exige nenhum conhecimento mais apurado do tecnólogo e também produz uma quantidade de resíduos muito menor do que a produzida pelos métodos tradicionais.

Como é feita a identificação dos microrganismos pelo MALDI-TOF? Os organismos intactos são embebidos em uma solução matriz, que auxilia na subsequente disrupção e ionização das proteínas microbianas. A pequeno “spot” seco contendo as proteínas microbianas é excitado por um laser, que as transforma em um vapor ionizado altamente rico em proteínas ribossomais. Este analito ionizado entra em um tubo, chamado de tubo de voo aonde são separados pela sua relação de massa-carga, de forma que os analitos menores chegam ao final do tubo, aonde existe um detector, mais rápidos do que os analitos maiores. Um espectro de massa é gerado, representando a quantidade de íons que atingem o detector, conforme o seu tempo de voo. Daí o nome MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Fligh)

A técnica MALDI-TOF ganhou aplicação clínica microbiológica quando foi possível acoplar os poderosos recursos analíticos da espectrometria de massa com as bases de dados de espectros que representam uma coleção abrangente de bactérias e fungos clinicamente relevantes. Existem atualmente dois sistemas comercialmente disponíveis (inclusive no Brasil) que incluem as bases de dados: o Biotyper Bruker (Bruker Daltonics), representado pela BD e o Vitek® MS (bioMérieux). Assim como acontece nos outros sistemas de identificação microbiana, existem limitações que são sinalizadas pelos equipamentos. Em geral, as identificações de bactérias Gram-negativas mais comuns e Gram-positivos apresentam grande assertividade, havendo mais restrições aos germes menos comuns, como bactérias anaeróbicas.

No nosso serviço, optados pela implantação do sistema Biotyper Bruker, por apresentar integração completa com os sistema automatizado Phoenix, que realizado o teste de sensibilidade.

Um dos maiores ganhos clínicos com a utilização da identificação por espectrometria de massa, está na aplicação em amostras de hemocultura, pois é possível a realização da identificação diretamente dos frascos de hemocultura, possibilitado um ganho precioso de horas que seriam gastas com o isolamento do germe e a identificação bioquímica, calculado em até 48. Sabemos que em casos de infecções sistêmicas, este tempo é extremamente precioso para o paciente. Muitos estudos também têm demonstrado a vantagem da identificação de fungos e de micobactérias através do MALDI-TOF. Em relação aos fungos, geralmente o processo é quase que inteiramente manual e depende em muito da expertise do microbiologista. Já em relação à identificação de micobactérias, geralmente depende do crescimento, que pode levar até 15 dias para a correta identificação. Já com o MALDI-TOF, estes processos ficam restritos a apenas algumas horas, que também podem ser extremamente preciosas em casos de infecções mais graves.

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MALDI-TOF, Perspectives

Comments on an article published in the journal Clinical Chemistry 59:2 (2013),MALDI-TOF Mass Spectrometry: Transformative Proteomics for Clinical Microbiology, Robin Patel

The modern microbiology laboratories operate using resources of high and low technology. Despite great advances in molecular diagnostic methods based on amplification of genetic material by the clinical microbiology laboratories, they still maintain a strong dependence of the traditional methods, as the culture for the diagnosis of infections caused by bacteria and fungi. This is due in large part to the multiplicity and variety of potentially pathogenic organisms in a single sample.

After isolation of microorganisms in culture media, whether liquid media or solid media, there is the process of identification and sensitivity testing, also known as sensitivity. The identification is made by morphological and tinctorial (eg cocci and rods, Gram-positive or Gram-negative) and also using biochemical tests, relating to the way that different bacteria metabolise various substrates. In most modern laboratories, this identification process is done by automated equipment (eg VITEK – BioMerieux, Microscan – Siemens and Phoenix – BD). These same devices are also used for the testing of sensitivity. While providing very reliable results in most cases, these methods are time consuming and relatively costly. One could estimate the total time for the final result of a culture of 48 to 72 hours, depending strongly on the type of specimen and the kind of the germ isolated.

The Introduction of Mass Spectrometry MALDI-TOF has considerably modified the routine clinical microbiology laboratories, allowing colonies of bacteria (including mycobacteria) and fungi to be identified in a much simpler and faster maner, even with greater accuracy than biochemical automated methods, and also cheaper.

The method is based on the combination of the application of mass spectrometry to analyze the protein component of microorganisms with bioinformatic data. Briefly, the initial cultivation as inoculation in culture media remains unaltered, however, after the appearance of colonies that can occur between 12 and 48 hours, the identification process done by MALDI-TOF takes about 1 hour. Indeed, identifying itself (analysis by the equipment) takes no more than two to three minutes, but there is a process of sample preparation before placing the sample on the equipment for analysis.

The result of identification by MALDI-TOF is more accurate than that obtained by the biochemical automated methods, because it do not depends on the metabolism of substances. Furthermore, the identification requires no more refined knowledge of the technologist and also produces a much smaller amount of residue than that produced by traditional methods.

How is the identification of microorganisms by MALDI-TOF? The intact organisms are embedded in a matrix solution, which assists in ionization and subsequent disruption of microbial proteins. The small “spot” containing dried microbial proteins is excited by a laser, which transforms into a highly ionized vapor-rich ribosomal proteins. This ionized analyte enters a tube, called the flight tube where they are separated by their mass-to-charge ratio, so that the analytes reach the lower end of the tube where there is a detector, where smaller are faster than larger analytes. A mass spectrum is generated, representing the amount of ions that reach the detector, according to the flight time. Hence the name MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization – Time Of Fligh)

The MALDI-TOF gained clinical application microbiological when it was possible to couple the powerful analytical capabilities of mass spectrometry with the databases of spectra that represent a comprehensive collection of clinically relevant bacteria and fungi. There are currently two commercially available systems (including Brazil) that include databases: the Biotyper Bruker (Bruker Daltonics), represented by BD and MS Vitek ® (bioMérieux). Just as in other microbial identification systems, there are limitations that are flagged by equipment. In general, the identification of Gram-negative and most common gram-positive exhibit great assertiveness, with further restrictions concerned to less common germs as anaerobic bacteria.

In our service, we opted for the Biotyper Bruker system deployment, because it presents complete integration with the Phoenix automated system, which performed the sensitivity test.

A major gain to the clinical use of identification by mass spectrometry is in the application on blood culture samples, because it is possible to perform the identification directly from blood culture bottles, made possible a gain precious hours that would be spent with the isolation of the germ and biochemical identification, estimated at up to 48 hours. We know that in cases of systemic infections, this time is extremely precious for the patient. Several studies have also demonstrated the advantage of identifying fungi and mycobacteria by MALDI-TOF. Regarding fungi, usually the process is almost entirely manual and much depends on the expertise of microbiologists. Regarding the identification of mycobacteria, usually depends on growth, which can take up to 15 days for correct identification. Already with the MALDI-TOF, these processes are restricted to a few hours, they may also be extremely valuable in cases of severe infections